伊東甲子太郎率いる御陵衛士の急速な倒幕勢力への接近は、新選組にとって致命的な脅威となりました。新選組の内部情報や隊士の配置を熟知する参謀が、薩摩藩と結託して幕府および新選組を排除しようとしている――土方歳三をはじめとする幹部陣の危機感は頂点に達します。
さらに決定打となったのが、新選組から御陵衛士へ間者（スパイ）として潜入していた斎藤一の密告でした。伊東が「近藤勇を暗殺し、新選組を解体する計画」を水面下で進めているという極秘情報が近藤・土方にもたらされたのです。これにより、新選組幹部は伊東甲子太郎の完全な抹殺を決断しました。
慶応3年11月18日（1867年12月13日）夜、事件は幕を開けます。近藤勇は「国事について相談したい」と伊東を七条醒ヶ井の妾宅に招き、歓待の酒宴を開きました。伊東は警戒心を解き、酒を酌み交わして心地よく酔った状態で帰路につきます。その途上、油小路木津屋橋の辻（京都市下京区）に差し掛かった瞬間、待ち伏せしていた新選組隊士・大石鍬次郎らの槍が伊東の喉元を深々と貫きました。
致命傷を負いながらも、伊東は刀を抜き放ち「奸賊ばら！」と一喝して敵数名を薙ぎ倒したと伝えられています。しかし力尽き、本光寺の門前付近で無念の絶命を遂げました。享年33の若さでした。
新選組の残虐な作戦はここで終わりませんでした。伊東の遺体を油小路の辻に囮として放置し、遺体を引き取りに現れた御陵衛士たちを一網打尽にする罠を仕掛けたのです。知らせを受けて駆けつけた御陵衛士一行は、潜伏していた40名以上の新選組隊士に包囲され、激しい白兵戦が勃発。藤堂平助や服部武雄ら奮戦空しく討死し、鈴木三樹三郎や加納鷲雄らは辛くも脱出して薩摩藩邸へと逃げ込みました。これが幕末史に名高い「油小路の変（あぶらのこうじのへん）」の凄惨な真相です。
